Czasopismo Polskiego Towarzystwa Andrologicznego Journal of Polish Society of Andrology

ZNACZENIE OCENY STATUSU CHROMATYNY PLEMNIKÓW LUDZKICH W WARUNKACH NATURALNEGO POCZĘCIA
THE SIGNIFICANCE OF EVALUATION OF HUMAN SPERM CHROMATIN STATUS IN NATURAL CONCEPTION

Kamil Gill *, Małgorzata Piasecka
Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie
*Autor do korespondencji/corresponding author: Kamil Gill, Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, 70-210 Szczecin, ul. Żołnierska 48
tel. 91 48 00 907, e-mail: kamil.gill@pum.edu.pl Otrzymano/received: 05.05.2020 r. Zaakceptowano/accepted: 15.06.2020 r.
DOI: 10.26404/PAO_2353-8791.2020.03
Kamil Gill – dr n. med., biolog, absolwent Uniwersytetu Szczecińskiego. Pierwszy autor i współautor artykułów naukowych, opublikowanych w renomowanych polskich i zagranicznych czasopismach naukowych. Laureat Nagrody Polskiego Towarzystwa Andrologicznego im. Prof. Bokińca. Członek Polskiego Towarzystwa Andrologicznego, Polskiego Towarzystwa Biologii Komórki, Polskiego Towarzystwa Histochemików i Cytochemików oraz Polskiego Towarzystwa Biologii Rozrodu. Od 2019 r. adiunkt w Zakładzie Histologii i Biologii Rozwoju Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie.
Kamil Gill – PhD, biologist, graduate of the University of Szczecin. The first author and co-author of articles published in renowned Polish and foreign scientific journals. Winner Polish Society of Andrology Award of Prof. Bokiniec for young scientists. Member of the Polish Society of Andrology, Polish Society of Cell Biology, Polish Society of Histochemistry and Cytochemistry as well as Polish Society of Reproductive Biology. Since 2019 senior lecturer in Department of Histology and Developmental Biology at Pomeranian Medical University in Szczecin.
Streszczenie

W niniejszym artykule dokonano przeglądu piśmiennictwa dotyczącego klinicznego znaczenia statusu chromatyny męskich komórek rozrodczych dla uzyskania poczęcia w warunkach naturalnych. Ponadto uwzględniono powszechnie stosowane techniki badawcze ujawniające nieprawidłowości chromatyny plemników na różnych poziomach jej organizacji (np. jedno- i dwuniciowe pęknięcia nici DNA, podwyższoną zawartość histonów, obniżoną protaminację, nieprawidłową kondensację). Opisane zostały także trzy główne teorie tłumaczące pochodzenie uszkodzeń chromatyny męskich gamet: zaburzenia reorganizacji chromatyny, „nieudana” apoptoza komórek gremialnych i stres oksydacyjny. Zwrócono także uwagę na czynniki etiologiczne odpowiedzialne za ich powstawanie (żylaki powrózka nasiennego, choroby systemowe, infekcje męskiego układu płciowego, zaburzenia hormonalne, niezdrowy styl życia, szkodliwe czynniki środowiskowe, czynniki jatrogenne, zaawansowany wiek mężczyzny). W celu zaprezentowania klinicznego znaczenia dojrzałości i integralności genomu plemników, z uwzględnieniem stosowanych przez badaczy testów, przedstawiono różnice między mężczyznami płodnymi oraz zdrowymi ochotnikami z normozoospermią a mężczyznami niepłodnymi lub niepłodnymi pochodzącymi z par z historią nawracających poronień. Mężczyźni niepłodni mieli wyższy odsetek plemników z uszkodzonym materiałem genetycznym. Wykazano, że metody oceny statusu chromatyny miały dobrą lub bardzo dobrą wartość predykcyjną dla odróżnienia mężczyzn płodnych od niepłodnych lub od mężczyzn z par, u których doszło do utraty ciąży. Z przeglądu piśmiennictwa wynika, że status chromatyny plemników jest jednym z kluczowych czynników etiologicznych męskiej niepłodności. Słowa kluczowe: chromatyna plemnika, zapłodnienie, niepłodność, poronienia

Abstract

The present paper aimed to describe the role of the sperm chromatin status in natural conception. In addition, the commonly used research techniques able to reveal abnormalities in sperm chromatin organization at various levels (e.g. single- and double-strand breaks in DNA, increase in histone content, deficiency in protamination, abnormal condensation) were included. Moreover, three main theories explaining the origin of chromatin damage in male gametes (disorders of chromatin reorganization, ‘abortive’ apoptosis of germinal cells, oxidative stress) were described. Additionally, the etiological factors of sperm chromatin damage (varicocele, systemic diseases, infections of the male reproductive system, hormonal disorders, unhealthy lifestyle, harmful environmental factors, iatrogenic factors, advanced paternal age) were taken to the consideration. To evaluate the clinical utility of the sperm genome maturity and integrity with particular attention on type of used laboratory methods, the differences between fertile men and healthy volunteers with normozoospermia vs. infertile ones and infertile men from couples with a history of recurrent miscarriages were discussed. The higher percentage of sperm cells with damaged genetic material was found in infertile men. Moreover, it was shown that the methods of sperm chromatin status evaluation had good or very good predictive value to distinguish fertile men from infertile or infertile male partners in couples experiencing recurrent pregnancy loss. Thus, the literature review shows that sperm chromatin status is one of the key etiological factors of male infertility. Key words: sperm chromatin, fertilization, infertility, miscarriage

Skróty / Abbreviations

8-OHdG – 8-hydroksy-2’-deoksyguanozyna (ang. 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine); AB – błękit aniliny (ang. anilin blue); AUC – pole powierzchni pod krzywą (ang. area under curve); ATP – adenozyno-5’-trifosforan (ang. adenosine-5’-triphosphate); BER – wycinanie par zasad azotowych (ang. base excision repair); CMA3 – chromomycyna A3 (ang. chromomycin A3); DFI – indeks fragmentacji DNA (ang. DNA fragmentation index); dNTP – deoksynukletydy (ang. deoksynucletides); dsSDF – dwuniciowe pęknięcia DNA (ang. double stranded DNA fragmentation); DTT – ditiotreitol (ang. dithiothreitol); EDC – związki chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną (ang. endocrine disrupting chemicals/ compounds); HDS – intensywne wiązanie oranżu akrydyny (ang. high DNA stainability); NOX5 – oksydaza NAPH 5 (ang. NADPH oxidase 5), OA – oranż akrydyny (ang. acridine orange); OGG1 – glikozylaza 8-oksoguaniny (ang. 8-oxoguanine DNA glycosylase); OR – iloraz szans (ang. odds ratio); RFT – reaktywne formy tlenu (ang. reactive oxygen species); SCD – test dyspersji chromatyny (ang. sperm chromatin dispersion); P1 – protamina 1 (ang. protamine 1); P2 – protamina 2 (ang. protamine 2); SCSA – test oceniający strukturę chromatyny plemników (ang. sperm chromatin structure assay); ssSDF – jednoniciowe pęknięć DNA (ang. single stranded DNA fragmentation); TB – błękit toluidyny (ang. toluidin blue); TdT – terminalna transferaza deoksynukleotydów (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase); TUNEL – znakowanie końców nacięć nici DNA za pośrednictwem terminalnej transferazy deoksynukleotydowej (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling); WHO – Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Health Organization)

ZNACZENIE OCENY STATUSU CHROMATYNY PLEMNIKÓW LUDZKICH W WARUNKACH NATURALNEGO POCZĘCIA

Niepłodność partnerska dotyczy 15–20% par w wieku reprodukcyjnym chcących posiadać potomstwo. Stanowi to ok. 186 mln niepłodnych par na świecie ( Agarwal i wsp.,2019;) ( Inhorn i Patrizio, 2015;) ( Machen i Sandlow, 2020;) ( Murshidi i wsp., 2020;) ( Murshidi i wsp., 2020;) (Uppangala i wsp.,2016) Jest to problem nie tylko medyczny, ale także demograficzny, ekonomiczny i psychologiczny. Wiąże się on ze stale obserwowanym spadkiem dzietności w krajach rozwiniętych, wysokimi kosztami leczenia niepłodności, konsekwencjami gospodarczymi wynikającymi ze starzenia się społeczeństwa i psychologicznymi związanymi z niemożnością posiadania potomstwa. ( Agarwal i wsp.,2015, 2019;) (Chanduszko-Salska, 2016;) ( Machen i Sandlow,2020;) ( Szkodziak i wsp., 2020; ) (Vander Borght i wsp., 2018) Szacuje się, że udział czynnika męskiego w niepłodności partnerskiej wynosi ok. 50%. Współistnieje on z czynnikiem żeńskim w ok. 30%, a w ok. 20% jest czynnikiem izolowanym. Doniesienia z ostatnich lat ujawniają jednak, że w niektórych regionach geograficznych (Bliski Wschód) następuje zdecydowany wzrost udziału czynnika męskiego, który może wynosić aż 70% (Agarwal i wsp., 2015, 2019). Ponadto, mimo coraz większej wiedzy na temat molekularnych podstaw funkcjonowania ludzkiego organizmu i rozwoju technik weryfikujących procesy i struktury komórkowe, głównym andrologicznym narzędziem diagnostycznym wciąż pozostaje standardowa ocena seminologiczna. Jest ona przeprowadzana zgodnie z rekomendacjami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) (WHO,2010) i interpretowana w oparciu o ustalone wartości referencyjne. W wielu przypadkach jest niewystarczająca do precyzyjnego odróżniania mężczyzn niepłodnych od płodnych. Okazuje się bowiem, że nie zawsze mężczyźni z obniżonymi standardowymi parametrami nasienia są niepłodni i nie zawsze mężczyźni z normozoospermią są płodni. Szacuje się, że około 15% niepłodnych mężczyzn charakteryzuje się prawidłowym wynikiem podstawowego badania nasienia. (Agarwal i wsp., 2015, 2019;) ( Schulte i wsp., 2010) W takich przypadkach najprawdopodobniej mają miejsce nieprawidłowości molekularne, które mogą być przyczyną niepłodności idiopatycznej, stanowiącej aż 50% niepłodności męskiej (Agarwal i wsp., 2015, 2019;). Wymagają one wprowadzania dodatkowych i komplementarnych testów oceniających jakość męskich komórek rozrodczych na poziomie molekularnym, co niewątpliwie jest niezbędne do prawidłowego postępowania terapeutycznego. Wyniki badań doświadczalnych i klinicznych sugerują, że istotnym biomarkerem kompetencji biologicznej plemników może być status/jakość ich chromatyny, która może wpływać na: 1) czas oczekiwania na ciążę; 2) proces zapłodnienia; 3) rozwój zarodka; 4) wzrost ryzyka wystąpienia poronień; 5) zdrowie przyszłego potomstwa. (Agarwal i wsp., 2015, 2016, 2019;) (Cho i Agarwal, 2018;) (Cho i wsp., 2017;) (Machen i Sandlow, 2020;) ( Sharma i wsp.,2020;) (van der Horst i du Plessis, 2017) Dlatego też w niniejszym artykule poddano analizie wyniki badań naukowych dotyczące klinicznego znaczenia statusu chromatyny męskich komórek rozrodczych, z uwzględnieniem zastosowanych metod badawczych.

Etiologia i patomechanizm uszkodzeń chromatyny plemników

Uszkodzenia chromatyny plemników mogą przejawiać się na różnych poziomach jej organizacji. Ujawnia się: 1) jednoniciowe i dwuniciowe pęknięcia nici DNA; 2) niedojrzałość chromatyny związaną z zaburzoną jej przebudową podczas spermiogenezy obejmującą m.in. zastępowanie histonów jądrowych przez specyficzne białka chromatyny plemnika – protaminy 1 (P1, ang. protamine 1) i 2 (P2, ang. protamine 2) w procesie protaminacji; 3) nieprawidłową trzeciorzędową strukturę chromatyny, wyrażającą się nieprawidłową jej kondensacją. Wymienione zaburzenia mogą być izolowane lub współistniejące. W celu ich wykazania należy zastosować komplementarne, wzajemnie uzupełniające się testy . (Henkel i Leisegang, 2020;) (Panner Selvam i wsp., 2020;) (Ribas-Maynou i Benet, 2019;) (Sharma i wsp., 2020;) (Ward, 2017) Molekularny patomechanizm prowadzących do nieprawidłowości w obrębie struktury chromatyny plemników nie jest w pełni poznany. Istnieją jednak trzy główne teorie tłumaczące pochodzenie jej uszkodzeń: 1) zaburzenia przebudowy chromatyny; 2) „nieudana” apoptoza (ang. ‘abortive’ apoptosis) komórek gremialnych; 3) stres oksydacyjny (rycina 1). (Agarwal i Sengupta, 2020;) (Bui i wsp., 2018;) (Cho i Agarwal, 2018;) (Majzoub i wsp., 2020;) (Muratori i wsp., 2019;) (Panner Selvam i wsp., 2020;) (Sakkas i El-Fakahany, 2018; (Sakkas i wsp., 2003;) (Schulte i wsp.,2010;) (Sharma i wsp., 2020;) (Ward, 2017)

Zaburzenia przebudowy chromatyny

Nukleoproteinowy kompleks tworzący chromatynę plemników jest unikatowy. Zawiera on DNA upakowany w formie nukleosomów charakterystycznych dla komórek somatycznych oraz toroidów specyficznych dla męskich gamet. Jedynie 5–15% chromatyny związanych jest z histonami budującymi nukleosomy zawierające oktamer histonów (histony: H2A, H2B, H3 i H4), na który nawinięta jest helisa DNA. Natomiast pozostała część chromatyny zorganizowana jest w postaci toroidów, w skład których nie wchodzą histony, tylko protaminy. Białka te cechuje wysoka zawartość cysteiny i argininy, co warunkuje silną kondensację DNA. Toroidy tworzone są przez ściśle upakowane spiralne pętle DNA (50–100 kpz – tysiąc par zasad). Struktury te powiązane są ze sobą za pomocą łącznikowych pętli DNA (ang. toroid linker) o długości poniżej 1000 pz (par zasad). Pętle te nie tylko integrują sąsiadujące ze sobą toroidy, ale również wiążą je z włóknami macierzy jądrowej. Toroidy ściśle do siebie przylegają bocznymi powierzchniami i tworzą chromatynowe struktury wyższego rzędu. Taka organizacja chromatyny sprawia, że materiał genetyczny plemnika jest 6–20-krotnie mocniej skondensowany niż ten znajdujący się w komórkach somatycznych. (Björndahl i Kvist, 2014;)

(Patankar i Parte, 2017;)

(Ward, 2017)

Aby proces przebudowy chromatyny męskich komórek rozrodczych był możliwy, konieczne są modyfikacje epigenetyczne histonów somatycznych spermatocytów (fosforylacja, ubikwitynacja, sumoilacja, ADP-rybozylacja, metylacja) i histonów jądrowych wydłużających się spermatyd (np. hiperacetylacja histonu H4). Pierwsze z nich umożliwiają usunięcie histonów somatycznych okrągłej spermatydy i wbudowanie histonów jądrowych. Z kolei hiperacetylacja histonu H4 powoduje rozluźnienie struktury chromatyny. Z jednej strony promuje to wymianę histonów jądrowych na białka przejściowe TP1 i TP2, które w wydłużających się spermatydach zastępowane są przez P1 i P2 (proces protaminacji), z drugiej natomiast sprzyja uszkodzeniu DNA. Należy podkreślić, że usunięcie histonów jądrowych i wbudowanie białek przejściowych, a następnie protamin wymaga także aktywności topoizomerazy II, która odpowiedzialna jest za powstanie fizjologicznych przejściowych podwójnych nacięć nici DNA. (Hao i wsp., 2019;)

(Henkel i Leisegang, 2020;)

(Ward, 2017)

W końcowym etapie reorganizacji materiału genetycznego plemnika wolne końce DNA podlegają ligacji (łączeniu) katalizowanej także przez topoizomerazę II. Wynika z tego, że dojrzała chromatyna plemnika przy prawidłowej aktywności topoizomerazy II zawiera

integralny DNA, tym bardziej, że enzym ten również zaangażowany jest w naprawę materiału genetycznego. Funkcja tego enzymu jest kontrolowana przez polimerazę poli (ADP-rybozy), która jest aktywowana w obecności nacięć nici DNA. Rozważana jest hipoteza mówiąca o tym, że w przypadku nieprawidłowej aktywności tych enzymów może dojść do pojawienia się tzw. przetrwałych endogennych nacięć nici DNA, konsekwencją czego może być obecność w ejakulacie plemników z pofragmentowanym DNA. (Henkel i Leisegang, 2020;) (McPherson i Longo, 1992;) (Muratori i wsp., 2019;) ( Schulte i wsp., 2010) Co więcej, po zakończonej protaminacji ma miejsce dalsza kondensacja i stabilizacja struktury chromatyny, która przede wszystkim zachodzi w najądrzu i jest efektem tworzenia się mostków dwusiarczkowych (S–S) wewnątrz cząsteczek protamin i pomiędzy nimi. Należy podkreślić, że procesy te chronią materiał genetyczny przed uszkodzeniami, co wydaje się niezwykle istotne ze względu na brak systemów naprawczych DNA w dojrzałym plemniku. Zatem zaburzenia protaminacji i stabilizacji struktury chromatyny predysponują do powstania uszkodzeń jądrowego DNA. Wielu autorów ujawnia silną korelację między nieprawidłowo skondensowaną chromatyną plemnika (np. zwiększona zawartość histonów jądrowych, obniżona protaminacja, nieprawidłowy stosunek P1/P2) a uszkodzeniami jego jądrowego DNA. ( Bianchi i wsp., 1993;) ( Evenson,1990;) ( Gorczyca i wsp., 1993; ) ( Henkel i Leisegang, 2020;) ( Javed i wsp., 2019;) ( Manicardi i wsp., 1995) Ponadto wykazano związek między integralnością genomu plemników a obniżonymi standardowymi parametrami seminologicznymi. Obecnie uważa się, że nieprawidłowa dojrzałość chromatyny plemnika i obniżona jej integralność mogą być wskaźnikiem zaburzeń spermatogenezy (rycina 1). ( Gill i wsp.,2019a, 2019b;) ( Henkel i Leisegang, 2020; ) ( Jakubik-Uljasz i wsp., 2020;) ( Lopes i wsp., 1998;) ( McPherson i Longo, 1992;) ( Rosiak-Gill i wsp., 2019)

„Nieudana” apoptoza

Apoptoza, czyli zaprogramowana śmieć komórki, jest procesem zachodzącym w wielu komórkach ludzkiego organizmu, w tym w komórkach germinalnych. Ma ona szczególne znaczenie, gdyż jej efektywność gwarantuje selektywną eliminację komórek, w tym z wadliwym materiałem genetycznym, co w konsekwencji zmniejsza ryzyko zapłodnienia komórki jajowej plemnikiem nieprawidłowym. Ponadto zdolności komórek Sertolego do podtrzymywania komórek linii spermatogenicznej są ograniczone i eliminacja tych niedoskonałych jest wysoce uzasadniona, zwłaszcza w przypadku tworzenia bariery krew–jądro. Szacuje się, że u ssaków nawet 75% komórek germinalnych podlega temu procesowi. ( Sakkas i wsp., 2003;) ( Schulte i wsp., 2010;) ( Ward, 2017) Jedną z hipotez tłumaczących powstawanie uszkodzeń genomu plemników jest zjawisko określane terminem „nieudana” apoptoza (ang. ‘abortive’ apoptosis). Sugeruje się, że komórki, które weszły na szlak apoptozy z powodu m.in. uszkodzeń DNA (np. błędy replikacji DNA, nieudana naprawa DNA), mogą z niego „uciec” i finalnie nie podlegają eliminacji. Przemawia za tym fakt, iż u niepłodnych mężczyzn stwierdza się wysoki odsetek plemników z obniżoną jakością DNA, co zgodnie z tą hipotezą może być związane z aktywacją endonukleaz degradujących DNA podczas apoptozy. Jednocześnie w plemnikach tych stwierdza się ekspresję białek zaangażowanych w proces apoptozy: receptora śmierci FAS, białka p53, Bcl-2, polimerazy poli (ADP-rybozy) oraz kaspaz – kluczowych dla apoptozy proteinaz cysteinowych. Ponadto na powierzchni tych komórek ujawnia się obecność fosfolipidu fosfatydyloseryny – markera wczesnej apopotozy. Patomechanizm związany z „nieudaną” apoptozą nie został do końca wyjaśniony. Przypuszcza się, że ma miejsce nadekspresja białek antyapoptotycznych (np. Bcl-2 i Bcl-x). Brak równowagi między białkami proi antyapoptotycznymi może przyczynić się do zaburzeń spermatogenezy. Zwraca się także uwagę, że zawartość ligandu FAS prawdopodobnie jest zbyt mała, jak również sygnalizacja komórkowa przez receptor FAS i inne receptory nie funkcjonuje w sposób poprawny, zwłaszcza przy bardzo intensywnej spermatogenezie prowadzącej do produkcji nawet 200 × 106 plemników dziennie. W efekcie opisanych zjawisk zwiększa się liczba nieprawidłowych komórek rozrodczych w ejakulacie. Uważa się, że w takich przypadkach ma miejsce brak synchronizacji spermatogenezy z apoptozą. ( Ammar i wsp., 2019;) ( Henkel i Leisegang,2020;) ( Muratori i wsp., 2006, 2019;) ( Panner Selvam i wsp.,2020;) ( Sakkas i El-Fakahany, 2018;) ( Sakkas i wsp., 2003;) ( Simon i wsp., 2017; ) ( Ward, 2017)

Stres oksydacyjny i reaktywne formy tlenu

Równowaga oksydacyjno-redukcyjna (redoks) nasienia jest niezwykle istotna dla funkcjonowania plemników. Reaktywne formy tlenu (RFT, ang. reactive oxygen species) biorą udział m.in. w procesie spermatogenezy, kapacytancji, hiperaktywacji, reakcji akrosomalnej i fuzji plemnika z oocytem, które są niezbędnymi etapami na drodze do uzyskania zapłodnienia (rycina 2). ( Adewoyin i wsp.,2017;) ( Agarwal i Sengupta, 2020;) ( Aitken, 2020;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Aitken i wsp., 2015) Zaburzenie tego balansu, poprzez nadmierne generowanie wolnych rodników i/lub niewydolność systemów antyoksydacyjnych, może prowadzić do powstania stanu stresu oksydacyjnego, którego konsekwencjami mogą być zaburzenia spermatogenezy i uszkodzenia plemników, w tym ich DNA. Jest to bardzo istotny problem, ponieważ szacuje się, że nawet 80% mężczyzn z niepłodnością idiopatyczną ma podwyższoną zawartość RFT w nasieniu. Dlatego też wielu autorów wskazuje stres oksydacyjny nasienia jako istotny czynnik etiologiczny niepowodzeń w rozrodzie (rycina 1). (Agarwal i wsp., 2019;) (Agarwal i Sengupta, 2020;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Aitken i wsp., 2015;) ( Elbardisi i wsp., 2020;) ( Henkel i Leisegang, 2020;) ( Henkel i Solomon, 2018;) ( Majzoub i wsp., 2018, 2020;) ( Simon i wsp., 2017) Zaburzenia równowagi redoks wpływają na męską płodność poprzez peroksydację błon lipidowych męskich gamet, która prowadzi do powstania cytotoksycznych aldehydów, np. 4-hydroksynonenalu (4HNE, ang. 4-hydroxynonenal) i akroleiny. Ponadto ma miejsce oksydacja białek oraz DNA powodująca jego fragmentację i powstawanie w nim adduktów, np. 8-hydroksy-2’-deoksyguanozyny (8-OHdG, ang. 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine) (rycina 1). Warto również zaznaczyć, że plemniki wykazują aktywność tylko jednego enzymu odpowiedzialnego za naprawę oksydacyjnych uszkodzeń DNA, którym jest glikozylaza 8-oksoguaniny (OGG1, ang. 8-oxoguanine DNA glycosylase). ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Henkel i Leisegang,2020) Enzym ten katalizuje usuwanie 8-OHdG oraz naprawę DNA poprzez wycinane par zasad azotowych (BER, ang. base excision repair). Co ciekawe, aktywność tego enzymu hamowana jest m.in. przez kadm zawarty w dymie papierosowym. Stąd też u palaczy obserwuje się wyższy poziom uszkodzeń DNA, w tym 8-OHdG. Może to nie tylko negatywnie wpływać na płodność, ale również na zdrowie przyszłych pokoleń. U potomstwa mężczyzn palących papierosy istotnie częściej stwierdza się złośliwe nowotwory, na co – jak sugerują – badacze ma wpływ jakość DNA plemników w momencie zapłodnienia. ( Aitken i Baker, 2013;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Aitken i wsp., 2015;) ( Henkel i Leisegang,2020) Należy podkreślić, że jednym z głównych źródeł RFT w nasieniu są plemniki. Reaktywne formy tlenu powstają w mitochondriach wstawki plemnika, na poziomie łańcucha oddechowego zlokalizowanego w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Rolą tego łańcucha jest wytworzenie źródła energii w postaci adenozyno-5’-trifosforanu (ATP, ang. adenosine-5’-triphosphate). Obok ATP wytwarzane są także RFT (anionorodnik ponadtlenkowy, rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru i tlen singletowy), które w przypadku dysfunkcji i uszkodzeń mitochondriów mogą być nadmiernie generowane, powodując stres oksydacyjny zarówno w matriks mitochondrialnej, jak i w cytozolu komórki. ( Aitken, 2020;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Idelchik i wsp., 2017) Warto zaznaczyć,że nadmiar RFT pochodzący z mitochondriów może indukować apoptozę komórek rozrodczych poprzez aktywację kaspaz (wewnętrzpochodny szlak apoptozy) ( Aitken, 2020;) ( Aitken i Baker, 2013;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Grunewald i wsp., 2005) Ponadto źródłem RFT są także niedojrzałe formy plemników, szczególnie te posiadające resztkową cytoplazmę bogatą w błonową oksydazę zależną od NADPH (identyfikowaną jako NOX5, ang. NADPH oxidase 5). Enzym ten zaangażowany jest w intensywną generację RFT, głównie anionorodnika ponadtlenkowego i nadtlenku wodoru. ( Aitken i Drevet,2020;) ( Vatannejad i wsp., 2019) Podczas wędrówki męskich gamet przez najądrze dochodzi do bliskiego kontaktu ich form niedojrzałych z prawidłowymi, co skutkuje wzrostem ryzyka uszkodzenia plemnikowego DNA. Za stres oksydacyjny nasienia mogą być także odpowiedzialne leukocyty, których mechanizmem obronnym jest uwalnianie dużej ilości RFT podczas wybuchu tlenowego. Ponieważ jest to nieswoista i nieselektywna odpowiedź immunologiczna, uszkodzeniu ulegają nie tylko patogeny znajdujące się w nasieniu, ale również plemniki, tym bardziej że zdolność antyoksydacyjna nasienia jest niska. ( Agarwal i wsp., 2019;) ( Agarwal i Sengupta, 2020;) ( Aitken i Drevet, 2020;) ( Henkel i Solomon, 2018;) ( Majzoub i wsp., 2020) Opisane powyżej zjawiska wskazują, że RFT mogą uszkadzać DNA plemników nie tylko w sposób bezpośredni (oksydacyjne uszkodzenie DNA), ale także pośredni, bowiem w obecności RFT ma miejsce aktywacja kaspaz i endonukleaz (nieoksydacyjne uszkodzenie DNA). Za stres oksydacyjny nasienia mogą być także odpowiedzialne leukocyty, których mechanizmem obronnym jest uwalnianie dużej ilości RFT podczas wybuchu tlenowego. Ponieważ jest to nieswoista i nieselektywna odpowiedź immunologiczna, uszkodzeniu ulegają nie tylko patogeny znajdujące się w nasieniu, ale również plemniki, tym bardziej że zdolność antyoksydacyjna nasienia jest niska (Agarwal i wsp., 2019; Agarwal i Sengupta, 2020; Aitken i Drevet, 2020; Henkel i Solomon, 2018; Majzoub i wsp., 2020). Opisane powyżej zjawiska wskazują, że RFT mogą uszkadzać DNA plemników nie tylko w sposób bezpośredni (oksydacyjne uszkodzenie DNA), ale także pośredni, bowiem w obecności RFT ma miejsce aktywacja kaspaz i endonukleaz (nieoksydacyjne uszkodzenie DNA).

Czynniki etiologiczne uszkodzeń chromatyny

Czynniki etiologiczne uszkodzeń chromatyny Poza wymienionymi trzema głównymi teoriami tłumaczącymi powstawanie uszkodzeń DNA plemników istnieje szerokie spektrum osobniczozależnych endoi egzogennych czynników etiologicznych, które wpływają negatywnie na proces spermatogenezy. Zaliczyć do nich można m.in.: 1) niewydolność układu krążenia, w tym żylaki powrózka nasiennego; 2) choroby systemowe, takie jak cukrzyca, nowotwory; 3) przewlekłe infekcje, szczególnie prostaty i innych gruczołów dodatkowych męskiego układu płciowego; 4) zaburzenia hormonalne; 5) niezdrowy styl życia, w tym brak aktywności fizycznej, palenie tytoniu, nadużywanie alkoholu i innych środków odurzających oraz nadwaga; 6) szkodliwe czynniki środowiskowe, w tym promieniowanie jonizujące, toksyny czy też związki chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną (związki endokrynnie czynne, EDC, ang. endocrine disrupting chemicals/compounds); 7) czynniki jatrogenne takie jak krioprezerwacja nasienia; 8) zaawansowany wiek mężczyzny (>35.–40. r.ż.) i wynikająca z niego obniżona sprawność systemów naprawy DNA i antyoksydacyjnych. Warto również podkreślić, że patomechanizm uszkodzenia DNA plemników w wyniku wymienionych czynników w większości związany jest ze stresem oksydacyjnym (rycina 1). ( Bui i wsp., 2018;) ( Cho i Agarwal, 2018;) ( Elbardisi i wsp., 2020;) ( Henkel i Leisegang, 2020;) ( Panner Selvam i wsp., 2020; ) ( Ribas-Maynou i Benet, 2019;) ( Sakkas i El-Fakahany, 2018;) ( Schulte i wsp., 2010;) ( Simon i wsp., 2017)