POSTĘPY ANDROLOGII ONLINE , 2020, 7 (2)

Czasopismo Polskiego Towarzystwa Andrologicznego Journal of Polish Society of Andrology

KOMITET REDAKCYJNY

Redaktor naczelny:
Redaktor naczelny:dr hab. n. med., prof. nadzw. PUM Małgorzata Piasecka, Szczecin
Zastępca redaktora naczelnego: prof. dr hab. n. med. Jolanta Słowikowska-Hilczer, Łódź
Redaktor pomocniczy: dr n. med. Kamil Gill, Szczecin
Sekretarz redakcji:dr hab. n. med. Agnieszka Kolasa-Wołosiuk, Szczecin
Skarbnik redakcji:dr hab. n. med. Renata Walczak-Jędrzejowska, Łódź
Członkowie komitetu redakcyjnego:
dr n. med. Szymon Bakalczuk, Lublin
dr n. med. Leszek Bergier, Kraków
prof. dr hab. n. biol. Barbara Bilińska, Kraków
prof. dr hab. n. med. Barbara Darewicz, Białystok
Prof., MD, PhD Aleksander Giwercman, Malmö, Sweden
PhD Yvonne Lundberg Giwercman, Malmö, Sweden
Prof., PhD (UPE/NMMU) and PhD (US) Gerhard Van der Horst, Republika Południowej Afryki (Bellville, Republic of South Africa)
prof. dr hab. n. med. Grzegorz Jakiel, Warszawa
prof. dr hab. n. med. Piotr Jędrzejczak, Poznań
dr hab. n. med., prof. UMK Roman Kotzbach, Bydgoszcz
prof. dr hab. n. med. Krzysztof Kula, Łódź
lek. med. Robert Kulik, Warszawa
prof. dr hab. n. med. Maria Laszczyńska, Szczecin
dr hab. n. med. Grzegorz Ludwikowski, Bydgoszcz
prof. dr hab. n. med. Marek Mędraś, Wrocław
MD, PhD, DMSc Ewa Rajpert-De Meyts, Kopenhaga, Dania (Copenhagen, Denmark)
dr n. med. Aleksandra Robacha, Łódź
dr n. med. Maria Szarras-Czapnik, Warszawa
Adres redakcji:
Zakład Histologii i Biologii Rozwoju Wydział Nauk o Zdrowiu Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie 71-210 Szczecin ul. Żołnierska 48 tel. 91 48 00 917, 91 48 00 908 e-mail: mpiasecka@ipartner.com.pl
Projekt graficzny:
Waldemar Jachimczak
Małgorzata Piasecka
Kamil Gill
Korekta języka polskiego:Wojciech Markowski
Korekta języka angielskiego:Joanna Ingielewicz
Małgorzata Piasecka
Kamil Gill Skład i łamanie:
Waldemar Jachimczak

WPŁYW STATUSU CHROMATYNY PLEMNIKÓW LUDZKICH NA WYNIKI ROZRODU W WARUNKACH IN VITRO THE INFLUENCE OF HUMAN SPERM CHROMATIN STATUS ON IN VITRO FERTILIZATION OUTCOME

Kamil Gill 1*, Tomasz Machałowski 1,2, Klaudia Piasecka1, Patryk Harasny 3, Małgorzata Piasecka 1 Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, 2Klinika Perinatologii, Położnictwa i Ginekologii SPSK1, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, 3Klinika Urologii i Onkologii Urologicznej SPSK2, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie *Autor do korespondencji/corresponding author: Kamil Gill, Zakład Histologii i Biologii Rozwoju, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, 70-210 Szczecin, ul. Żołnierska 48 tel. 91 48 00 907, e-mail: kamil.gill@pum.edu.pl Otrzymano/received: 01.12.2020 r. Zaakceptowano/accepted: 21.12.2020 r. DOI: 10.26404/PAO_2353-8791.2020.04 Kamil Gill – dr n. med., biolog, absolwent Uniwersytetu Szczecińskiego. Pierwszy autor i współautor artykułów naukowych opublikowanych w renomowanych polskich i zagranicznych czasopismach naukowych. Laureat Nagrody Polskiego Towarzystwa Andrologicznego im. Prof. Bokińca. Członek Polskiego Towarzystwa Andrologicznego, Polskiego Towarzystwa Biologii Komórki, Polskiego Towarzystwa Histochemików i Cytochemików oraz Polskiego Towarzystwa Biologii Rozrodu. Od 2019 r. adiunkt w Zakładzie Histologii i Biologii Rozwoju Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie. Kamil Gill – PhD, biologist, graduate of the University of Szczecin. The first author and co-author of articles published in renowned Polish and foreign scientific journals. Winner Polish Society of Andrology Award of Prof. Bokiniec for young scientists. Member of the Polish Society of Andrology, Polish Society of Cell Biology, Polish Society of Histochemistry and Cytochemistry as well as Polish Society of Reproductive Biology. Since 2019 senior lecturer in Department of Histology and Developmental Biology at Pomeranian Medical University in Szczecin.

Streszczenie

Poniższy artykuł jest kontynuacją poprzedniego (Post Androl Online, 2020, 7(1), 30–43) i zawiera zebrane dane dotyczące oceny wpływu jakości chromatyny plemników ludzkich na rezultaty procedury zapłodnienia in vitro. Przeanalizowano wyniki badań, w których wykorzystano powszechnie stosowane testy molekularne weryfikujące status chromatyny męskich komórek rozrodczych oraz przedyskutowano związek między tym statusem a procesem zapłodnienia, rozwojem zarodka, uzyskaniem ciąży, jej przebiegiem oraz ryzykiem poronienia i szansą na urodzenie żywego dziecka. Większość autorów uważa, że w wielu przypadkach wzrost stopnia uszkodzeń chromatyny męskich gamet niekorzystnie wpływa na każdy z ocenianych etapów rozwoju zarodka i przebieg ciąży. Jednak wyniki badań nie zawsze są jednoznaczne i oczywiste. Istnieją doniesienia, w których nieprawidłowości chromatyny plemnika niekoniecznie wpływają na wszystkie badane etapy rozwoju zarodka i przebieg ciąży. Ponadto niektórzy autorzy nie potwierdzają istnienia związku między statusem chromatyny plemników a sukcesem procedury zapłodnienia in vitro. Sugeruje się, że brak zgodności wyników uzyskanych przez autorów może być efektem wykorzystania przez nich różnych metod selekcji męskich gamet, odmiennych procedur zapłodnienia in vitro i testów oceny statusu chromatyny męskich komórek rozrodczych oraz odmiennych narzędzi statystycznych służących analizie uzyskanych danych. Należy także podkreślić, że badania prezentowane w piśmiennictwie wykonywane były na grupach, które wykazywały dużą heterogenność (odmienne liczebności grup, struktura wieku badanych i przyczyny niepłodności). Niemniej jednak w wielu najnowszych doniesieniach autorzy wskazują, że uszkodzenie chromatyny plemników jest istotnym determinantem sukcesu rozrodczego w warunkach zapłodnienia in vitro i w zależności od wartości tego parametru proponuje się różne scenariusze terapeutyczne. Słowa kluczowe: chromatyna plemnika, zapłodnienie in vitro, rozwój zarodka, ciąża, poronienia

Abstract

The following article is a continuation of pervious one (Post Androl Online, 2020, 7(1), 30–43) and contains a compilation of scientific reports concerning the impact of human sperm chromatin quality on in vitro fertilization outcomes. In this paper, the results of commonly used molecular sperm chromatin were presented. Furthermore, the relationships between sperm chromatin maturity/ integrity and the fertilization, embryo development, the chance of getting pregnant, risk of miscarriage and chance of live birth were widely discussed. Most authors reports that in many cases the increase in the level of sperm chromatin damage adversely affects embryo development and the course of pregnancy. However, the results are not always in line and obvious. There are scientific papers in which the abnormalities of the sperm chromatin do not necessarily affect all of the embryo development stages and the course of pregnancy. Moreover, some authors do not confirm the existence of a associations between the sperm chromatin status and the in vitro fertilization outcomes. It has been suggested that the inconsistency of the obtained data may result from: 1) different methods used for male gametes selection, 2) different in vitro fertilization procedures, 3) diverse sperm chromatin tests and 4) different statistical tools used to analyze the obtained data. Moreover, it should be highlighted that the findings presented in the scientific papers were carried out on the high heterogeneity groups (different subjects, age structure of enrolled individuals and causes of infertility). However, in many recent reports, the authors indicate that high sperm chromatin quality is an important determinant of reproductive success in in vitro conditions. According to the level of sperm chromatin abnormalities proper therapeutic scenario should be chosen. Key words: sperm chromatin, in vitro fertilization, embryo development, pregnancy, miscarriage

Skróty / Abbreviations

β-hCG – podjednostka β ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (ang. human chorionic gonadotropin β-subunit); AB – błękit aniliny (ang. anilin blue); ART – techniki wspomaganego rozrodu (ang. assisted reproductive technology); CMA3 – chromomycyna A3 (ang. chromomycin A3); DFI – indeks fragmentacji DNA (ang. DNA fragmentation index); DGC – selekcja plemników z wykorzystaniem wirowania na gradiencie stężeń (ang. density gradient centrifugation); HDS – intensywne wiązanie oranżu akrydyny (ang. high DNA stainability); FR – odsetek zapłodnionych oocytów (ang. fertilization rate); ICM – węzeł zarodkowy (ang. inner cell mass); ICSI – docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ang. intracytoplasmic sperm injection); IMSI-MSOME – zapłodnienie ISCI z wykorzystaniem plemników poddanych szczegółowej ocenie morfologicznej z wykorzystaniem 6000–13000-krotnego powiększenia (ang. intracytoplasmic morphologically selected sperm injection with motile sperm organelle morphology examination); IUI – inseminacja domaciczna (ang. intrauterine insemination); MESA-ICSI – zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem plemników pobranych aspiracyjnie z najądrza (ang. microscopic epididymal sperm aspiration); m-TESE-ICSI – zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem plemników pobranych mikrochirurgicznie z jądra (ang. microsurgical testicular sperm extraction); OA – oranż akrydyny (ang. acridine orange); OR – iloraz szans (ang. odds ratio); SCD – test dyspersji chromatyny plemników (ang. sperm chromatin dispersion test); SCSA – ocean struktury chromatyny plemników (ang. sperm chromatin structure assay); TB – błękit toluidyny (ang. toluidin blue); TE – trofoektoderma (ang. trophoblast); TESA-ICSI – zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem plemników pobranych aspiracyjnie z jądra (ang. testicular sperm aspiration); TUNEL – znakowanie końców nacięć nici DNA za pośrednictwem terminalnej transferazy deoksynukleotydowej (ang. terzaminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling)

Na przestrzeni ostatnich kilku dekad ma miejsce intensywny rozwój technik wspomaganego rozrodu (ART, ang. assisted reproductive technology), głównie klasycznego zapłodnienia pozaustrojowego in vitro (IVF, ang. in vitro fertilization) i docytoplazmatycznej iniekcji plemnika (ICSI, ang. intracytoplasmic sperm injection). W przypadku tej drugiej techniki w zależności od sposobu wyselekcjonowania męskich gamet lub ich pozyskiwania wyróżnia się: 1) zapłodnienie z wykorzystaniem plemników ruchliwych i morfologicznie prawidłowych (IMSI- -MSOME, ang. intracytoplasmic morphologically selected sperm injection with motile sperm organelle morphology examination), 2) aspirowanych z najądrza (MESA-ICSI, ang. microscopic epididymal sperm aspiration), 3) aspirowanych z jądra (TESA-ICSI, ang. testicular sperm aspiration) i 4) uzyskanych poprzez biopsję jądra (m-TESE, ang. microsurgical testicular sperm extraction). Początkowo sądzono, że w przypadku zastosowania tych technik, które szczególnie omijają naturalne bariery, na jakie napotyka plemnik podczas fizjologicznego zapłodnienia, wnikliwa, zwłaszcza molekularna weryfikacja męskich komórek rozrodczych niekoniecznie musi mieć znaczenie kliniczne. Jednakże obserwowane nieuzasadnione czynnikiem żeńskim niepowodzenia w tych procedurach sprawiły, że ocena jakości męskich gamet ponownie stała się obiektem badań doświadczalnych i klinicznych mających na celu weryfikację wpływu czynnika męskiego na prognozowanie sukcesu reprodukcyjnego w warunkach in vitro Benagiano i wsp., 2017; Kirkman-Brown i De Jonge, 2017; Piasecka i wsp., 2021; Rogenhofer i wsp., 2017. Warto również podkreślić, że zastosowanie nawet metody IMSI-MSOME, podczas której embriolog dokonuje zapłodnienia komórki jajowej jednym precyzyjnie wyselekcjonowanym plemnikiem, nie daje gwarancji wybrania gamety wolnej od wad substrukturalnych i molekularnych. Co więcej, ominięcie naturalnych barier, na jakie plemnik natrafia w trakcie spotkania się z komórką jajową, i uzyskanie zapłodnienia z wykorzystaniem uszkodzonego plemnika może stać się przyczyną nieprawidłowości obserwowanych podczas wczesnego rozwoju zarodka, przebiegu ciąży bądź też chorób u potomstwa, co niewątpliwie może wiązać się ze wzrostem ryzyka przeniesienia defektów genetycznych (rycina 1) Drenth Olivares i wsp., 2019; (Jauniaux i wsp.,2020;) (Piasecka i Gill, 2021;) ( Spector i wsp., 2019;) (Taylor i wsp., 2014;) ( Ventura-Juncá i wsp., 2015) . Dlatego też prognozowanie sukcesu rozrodczego i oszacowanie ryzyka genetycznego wymaga prowadzenia badań weryfikujących jakość męskich gamet na poziomie molekularnym w przypadku wykorzystania technik zapłodnienia pozaustrojowego (Krausz i wsp., 2018;) ( Piasecka i wsp., 2021;Watanabe, 2018). Status chromatyny plemników (budowa, kondensacja, integralność) to jeden z najistotniejszych biomarkerów





strona nr.8 i 9 niepłodności męskiej, gdyż jak wskazuje wiele najnowszych doniesień, determinuje on proces zapłodnienia, rozwój zarodka i uzyskanie ciąży nie tylko w warunkach naturalnej koncepcji, ale również wspomaganej medycznie (Agarwal i wsp., 2020;) ( Borges i wsp., 2019;). (Chen i wsp., 2020;) ( Gill i Piasecka,2020;). (Jerre i wsp., 2019;) ( Parrella i wsp., 2019;). (Tang i wsp.,2020; ) (Zheng i wsp., 2018 ) . Z drugiej strony, nie można pominąć faktu, że dane dotyczące wpływu jakości materiału genetycznego plemników na parametry embriologiczne i dalszy przebieg ciąży często są niejednoznaczne i nieoczywiste, a nawet pozostają ze sobą w sprzeczności. Wynikać to może z: 1) metod selekcji męskich gamet, 2) zastosowania różnych procedur zapłodnienia pozaustrojowego, 3) wykorzystania odmiennych metod oceny chromatyny męskich gamet, w których przyjmuje się różne (często empirycznie wyznaczane) wartości graniczne uznane za wynik prawidłowy tych testów i 4) heterogenności par objętych badaniami (odmienne liczebności grup, struktura wieku badanych i przyczyny niepłodności) (Green i wsp., 2020;) (Iranpour, 2014; ) (Lopes i wsp.,1998;) (Oleszczuk i wsp., 2016;) (Pregl Breznik i wsp., 2013;) (Velez de la Calle i wsp., 2008; ) (Wdowiak i wsp., 2015; ) (Xue i wsp., 2016) . Dodatkową trudność w ocenie wpływu statusu chromatyny na wyniki procedury zapłodnienia in vitro stanowi zdolność oocytu do naprawy plemnikowego DNA (rycina 1). Ponadto w przypadku technik wykorzystujących zapłodnienie in vitro zarodki transferowane do macicy podlegają selekcji przeprowadzanej przez embriologa, co również może utrudnić ocenę wpływu jakości chromatyny męskich gamet na przebieg ciąży (Fishel i wsp., 2020;) (Gill i wsp., 2018;) (Piasecka i Gill, 2021;) (Sigalos i wsp., 2016). Do weryfikacji dojrzałości chromatyny plemników stosuje się m.in. test z błękitem aniliny (AB, ang. aniline blue), chromomycyną A3 (CMA3, ang. chromomycin A3), błękitem toluidyny (TB, ang. toluidine blue), które odpowiednio identyfikują nadmiar resztkowych histonów, stopień protaminacji i nieprawidłowości kondensacji chromatyny. Natomiast w ocenie integralności jądrowego DNA plemników mają zastosowanie wystandaryzowane testy diagnostyczne, takie jak test dyspersji chromatyny plemników (SCD, ang. sperm chromatin dispersion) umożliwiający określenie odsetka plemników z pofragmentowanym DNA (SDF, ang. sperm DNA fragmentation) oraz test SCSA (ang. sperm chromatin structure assay) z wykorzystaniem oranżu akrydyny (OA, ang. acridine orange) umożliwiający określenie indeksu fragmentacji strona 10 ---------------------------


DNA plemników (DFI, ang. DNA fragmentation index) oraz odsetka plemników z dużą zawartością histonów jądrowych intensywnie wiążących OA (HDS, ang. high DNA stainability). Inne testy to test kometowy (ang. comet assay) i TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase- -mediated dUTP nick end-labeling) (Gill i Piasecka, 2020; Marchlewska i wsp., 2021) .

Wpływ statusu chromatyny plemników na proces zapłodnienia

Potwierdzeniem uzyskania prawidłowego zapłodnienia jest obecność dwóch ciałek kierunkowych oraz dwóch przedjądrzy – żeńskiego i męskiego, które powinny być zbliżonej wielkości, zlokalizowane blisko siebie w centralnej części oocytu. Zgodnie z rekomendacjami II konsensusu wiedeńskiego (ESHRE, 2017) weryfikacja zarodka powinna odbywać się 17 h ±1 h po zapłodnieniu. Należy jednak zaznaczyć, że w przypadku metody ICSI wytworzenie przedjądrzy może mieć miejsce 1,5–2 h wcześniej niż w przypadku klasycznego IVF. Natomiast brak widocznych w 1. dobie przedjądrzy lub obecność tylko jednego przedjądrza bądź trzech przedjądrzy uznaje się za cechy nieprawidłowego zapłodnienia (rycina 2) (Bączkowski i wsp., 2004;) (ESHRE, 2017;) (Gill i wsp., 2018;) (Nasiri i Eftekhari-Yazdi, 2015;) (Tang i wsp., 2020;) (Wdowiak i wsp., 2015).

Wraz ze wzrostem odsetka plemników z obniżonym statusem chromatyny rośnie ryzyko niepowodzeń w uzyskaniu zapłodnienia

stnienie zależności między jakością materiału genetycznego męskich komórek rozrodczych a procesem zapłodnienia potwierdzają prace licznych autorów. Wykazują oni istotnie niższy odsetek prawidłowo zapłodnionych oocytów w stosunku do wszystkich zapładnianych oocytów (FR, ang. fertilization rate) w przypadku niepłodnych par, w których partnerami byli mężczyźni z: y ≥10% plemników TUNEL-pozytywnych vs. <10% (metoda IVF i ICSI) (Benchaib i wsp., 2003), y >17,60% plemników TUNEL-pozytywnych vs. ≤17,60% (metoda ICSI) (Avendaño i wsp., 2010), y >20% plemników AB-pozytywnych vs. ≤20% (metoda IVF) (Hammadeh i wsp., 1998), y ≥30% plemników CMA3-pozytywnych vs. <30% (metoda ICSI) (Nasr-Esfahani i wsp., 2004), y ≥40% plemników CMA3-pozytywnych vs. <40% (metoda IVF i ICSI) (Tavalaee i wsp., 2009). Na podstawie analizy krzywej ROC (ang. receiver operating characteristic) oraz pola powierzchni pod krzywą (AUC, ang. area under curve) wykazano, że testy AB, CMA3, SCD mają istotną wartość predykcyjną1 dla uzyskania zapłodnienia w warunkach in vitro. Nie wykazano tej wartości dla testu OA (Iranpour, 2014; Nasr-Esfahani i wsp., 2001; Tang i wsp., 2020). Odpowiednio, była to: y średnia wartość predykcyjna testu AB (AUC = 0,614 przy optymalnej wartości granicznej2 20% plemników AB-pozytywnych, metoda IVF) (Nasr-Esfahani i wsp., 2001), y średnia wartość predykcyjna testu CMA3 (AUC = 0,646 przy optymalnej wartości granicznej 48% plemników CMA3-pozytywnych, metoda ICSI) (Iranpour, 2014), y satysfakcjonująca wartość testu SCD (AUC = 0,772 przy optymalnej wartości granicznej 31,25% SDF, metoda IVF) (Tang i wsp., 2020), y bardzo dobra wartość predykcyjna testu CMA3 (AUC = 0,911 przy optymalnej wartości granicznej 30% plemników CMA3-pozytywnych, metoda IVF) (Nasr-Esfahani i wsp., 2001). Wykazano także ujemną liniową zależność3 (korelację) między odsetkiem plemników AB-pozytywnych (r = −0,342) (metoda IVF) (Nasr-Esfahani i wsp., 2001), CMA3-pozytywnych (r = −0,291; −0,565; −0,564) (metody ICSI i IVF) (Nasr-Esfahani i wsp., 2001, 2005; Tavalaee i wsp., 2009), fragmentacją jądrowego DNA weryfikowaną testem kometowym (r = −0,318) (metoda IVF) (Simon i Lewis, 2011) oraz SDF (test SCD) (r = −0,245, r = −0,291) (metody IVF i ICSI) (Muriel i wsp., 2006; Tavalaee i wsp., 2009) a odsetkiem zapłodnionych oocytów. Co więcej, zaobserwowano, że wraz ze wzrostem odsetka SDF wydłużeniu ulega czas wytworzenia przedjądrzy będących markerem zapłodnienia – ujawniono dodatnią korelację (r = 0,473; metoda ICSI) między SDF a czasem pojawienia się przedjądrzy (Wdowiak i wsp., 2015). Stwierdzono również, że iloraz szans (OR, ang. odds ratio)4 na uzyskanie niskiego odsetka zapłodnionych oocytów (<40%) był 9,5-krotnie wyższy, gdy w nasieniu mężczyzn będących partnerami w niepłodnych parach leczonych metodą IVF odsetek plemników z pofragmentowanym jądrowym DNA (test kometowy) wynosił >40 w odniesieniu do mężczyzn z ≤40% plemników z fragmentacją jądrowego DNA. Natomiast OR, zgodnie z oczekiwaniami, dla uzyskania wysokiego odsetka zapłodnionych oocytów (>70%) był 24,18-krotnie niższy (Simon i Lewis, 2011). W przypadku testu TUNEL również potwierdzono związek między odsetkiem zapłodnionych oocytów a odsetkiem plemników z pofragmentowanym jądrowym DNA, np. w przypadku odsetka plemników TUNEL-pozytywnych <25 dla 43 par uzyskano >80% zapłodnionych oocytów, z kolei w przypadku odsetka plemników TUNEL-pozytywnych >25 dla żadnej z par nie uzyskano >80% zapłodnionych oocytów (Lopes i wsp., 1998).

Wpływ statusu chromatyny plemników na uzyskanie zapłodnienia w zależności od zastosowanej metody zapłodnienia in vitro

Lopes i wsp. (1998) ujawnili istotne ujemne korelacje (r = −0,230) między odsetkiem zapłodnionych oocytów a odsetkiem plemników TUNEL-pozytywnych w przypadku par leczonych metodą ICSI. Nie wykazali jednak tych korelacji, gdy zastosowano procedurę IVF. Także Xue i wsp. (2016) stwierdzili istotne ujemne korelacje (r = −0,433) między SDF a odsetkiem zapłodnionych oocytów tylko w grupie pacjentów leczonych metodą ICSI, nie wykazali ich w przypadku procedury IVF. Ponadto badacze ci uzyskali średnią wartość prognostyczną testu SCD dla zapłodnienia metodą ICSI (AUC = 0,680 przy optymalnej wartości granicznej 22,30% SDF). Przeciwne wyniki otrzymali inni autorzy (Borini i wsp., 2006; Pregl Breznik i wsp., 2013), którzy nie stwierdzili liniowego związku między wynikami testu TUNEL lub SCD a odsetkiem zapłodnionych oocytów w przypadku zastosowania procedury ICSI, ujawnili jednak ten związek w przypadku wykorzystania procedury IVF (odpowiednio: r = −0,219; r = −0,436). Kolejne badania przeprowadzone przez Oleszczuk i wsp. (2016) wykazały, że jeśli mężczyźni z par leczonych metodą IVF mieli ≤10% DFI, to uzyskano istotnie więcej zapłodnionych oocytów w porównaniu z parami, w których mężczyźni mieli >30% DFI, >20–30% DFI lub >10–20% DFI. Natomiast gdy w tych samych badaniach analizie poddano wyniki uzyskane dla grupy leczonej metodą ICSI, nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych. Podobnie Simon i wsp. (2010) wykorzystując procedurę IVF, uzyskali istotnie niższy odsetek zapłodnionych oocytów, kiedy w nasieniu odsetek plemników z obniżoną integralnością DNA (test kometowy) wynosił 61–100 w porównaniu z grupą mężczyzn, w nasieniu których stwierdzono 21–40% lub 0–20% plemników z pofragmentowanym DNA. Co więcej, autorzy ci uzyskali średnią wartość predykcyjną testu kometowego dla procesu zapłodnienia metodą IVF (AUC = 0,629 lub 0,648 przy optymalnych wartościach granicznych odpowiednio 56% i 44% plemników z pofragmentowanym DNA), natomiast nie wykazali opisanych zależności w grupie pacjentów leczonych metodą ICSI. Przytoczone powyżej dane sugerują, że w większości badanych przypadków wyraźniejszy wpływ statusu chromatyny na proces zapłodnienia stwierdzany jest, gdy wykorzystuje się metodę IVF. Sugestię tę potwierdzają wyniki badań, w których nie obserwuje się związku między uszkodzeniami chromatyny plemników a procesem zapłodnienia, kiedy w analizach statystycznych łącznie analizuje się dane uzyskane z procedur IVF i ICSI (Borini i wsp., 2006; Oleszczuk i wsp., 2016). Wydaje się, że w tym aspekcie niebagatelne znaczenie ma omijanie przez plemnik naturalnych barier, które pozwalają na wyselekcjonowanie gamet najbardziej atrakcyjnych biologicznie również pod względem jakości chromatyny, koreluje ona bowiem ze strukturą i funkcją plemnika, co potwierdzają badania wielu autorów (Evgeni i wsp., 2015; Gill i wsp., 2019a, 2019b; Homa i wsp., 2019; Jakubik- -Uljasz i wsp., 2020; Lu i wsp., 2018; Montjean i wsp., 2015; Piasecka i Gill, 2021). W przypadku procedury IVF plemnik musi wykazać zdolność do hiperaktywacji i wiązania się z kwasem hialuronowym wieńca promienistego zbudowanego z komórek ziarnistych otaczających komórkę jajową, co pozwala mu nie tylko przedostać się przez barierę utworzoną przez te komórki, ale także wyeksponować receptory dla komórki jajowej i w konsekwencji odbyć reakcję akrosomalną, i dalej przedostać się przez osłonę przejrzystą. Następna bariera, na jaką natrafia męska gameta, to oolemma – błona komórkowa oocytu. Tylko plemniki, które mają odpowiednie receptory, podlegają fuzji z oolemmą i są „wciągane” do cytoplazmy komórki jajowej (Piasecka i Gill, 2021). W przypadku zastosowania metody ICSI opisane powyżej naturalne bariery są pomijane.

Nieoczywisty wpływ statusu chromatyny plemników na uzyskanie zapłodnienia

Z przeglądu piśmiennictwa jednak wynika, że badania, których celem było m.in. znalezienie związku między statusem chromatyny plemników a procesem zapłodnienia w warunkach in vitro, nie zawsze dostarczają oczywistych i jednoznacznych danych. Benchaib i wsp. (2003) wykazali negatywny wpływ fragmentacji plemnikowego DNA (≥10% plemników TUNEL-pozytywny vs. <10%) na proces zapłodnienia, natomiast nie uzyskali statystycznie istotnych korelacji między odsetkiem plemników z pofragmentowanym DNA a odsetkiem zapłodnionych oocytów. W innych badaniach, pomimo że ujawniono istotnie niższy odsetek zapłodnionych oocytów dla par, w których mężczyźni mieli ≥10% plemników AB-pozytywnych (vs. <10%, metoda ICSI), nie wykazano tych różnic, gdy w nasieniu odsetek plemników AB-pozytywnych był wyższy (>20% vs. ≤20% lub >30% vs. ≤30%). Podobnie brak różnic statystycznie istotnych stwierdzono dla testu CMA3, OA i TB i nie ujawniono istotnych korelacji między wynikami zastosowanych testów a odsetkiem zapłodnionych oocytów (Sadeghi i wsp., 2009). Velez de la Calle i wsp. (2008) wyróżniając grupę mężczyzn z różną wartością SDF (10%, 15%, 18%, 20% i 25%) (test SCD), wykazali, że jedynie wartość 18% SDF miała kliniczne znaczenie dla uzyskania zapłodnienia metodą IVF i ICSI (współczynnik regresji krokowej = −5,52). Co więcej, Iranpour (2014) z jednej strony wykazał istotne ujemne zależności między odsetkiem plemników CMA3-pozytywnych a odsetkiem zapłodnionych oocytów (metoda ICSI) (współczynnik regresji logarytmicznej = −0,052), z drugiej zaś nie stwierdził tych zależności w przypadku testów AB i OA (Iranpour, 2014). Z kolei Tang i wsp. (2020) ujawnili związek między SDF a odsetkiem zapłodnionych oocytów (metoda IVF), ale tylko w przypadku mężczyzn z astenozoopsermią. Autorzy ci uzyskali niższy odsetek zapłodnionych oocytów dla par, w których mężczyźni mieli astenozoospermię i SDF >31,25% w porównaniu z mężczyznami z astenozoospermią i z ≤31,25% SDF, natomiast nie wykazano tych różnic, gdy mężczyźni mieli normozoospermię i >31,25% SDF lub ≤31,25% SDF. Wyniki tych badań wyraźnie pokazują, że związek między SDF a procesem zapłodnienia może być zależny od heterogenności grup badanych mężczyzn. Również badania autorskie (Gill i wsp., 2018) prezentują niejednoznaczne dane. Wykazano w nich, że mężczyźni z par leczonych metodą ICSI, dla których uzyskano >50% zapłodnionych oocytów, mieli istotnie niższy odsetek plemników TB-pozytywnych w porównaniu z parami, dla których uzyskano ≤50% zapłodnionych oocytów. Co więcej, ujawniono, że test TB miał satysfakcjonującą wartość prognostyczną dla uzyskania >50% zapłodnionych oocytów (AUC = 0,705, przy optymalnej wartości granicznej 17% plemników TB-pozytywnych). Z drugiej strony nie zaobserwowano istotnych korelacji między odsetkiem plemników TB-pozytywnych oraz odsetkiem zapłodnionych oocytów, a w przypadku testu AB i CMA3 nie potwierdzono żadnych statystycznych zależności.

Brak wpływu statusu chromatyny plemników na uzyskanie zapłodnienia

Opublikowano również szereg doniesień naukowych, które niezależnie od metody oceny chromatyny plemników i zastosowanej procedury zapłodnienia pozaustrojowego nie wykazują zależności między jakością jądrowego DNA plemników a procesem zapłodnienia. W badaniach tych wykazuje się brak różnic w odsetku zapłodnionych oocytów między parami, w których mężczyźni mieli: y >15% DFI vs. ≤15% (ICSI) (Green i wsp., 2020), y >15% HDS vs. 5–15% lub vs. <5% (IVF i ICSI) (Lin i wsp., 2008), y >15% HDS vs. ≤15% (IVF) (Niu i wsp., 2011), y ≥20% plemników TUNEL-pozytywnych vs. <20% (ICSI) (Dariš i wsp., 2009), y ≥20% SDF vs. <20% (IVF i ICSI) (Sun i wsp., 2018), y ≥21% SDF vs. 11–20% lub vs. ≤10% (IVF) (Zheng i wsp., 2018), y >23,3% plemników TUNEL-pozytywnych vs. ≤24,3% (IVF i ICSI) (Henkel i wsp., 2003), y >27% DFI vs. 9–27% lub vs. <9% (IVF i ICSI) (Lin i wsp., 2008), y >27% DFI vs. ≤27% (IVF) (Niu i wsp., 2011), y >29% plemników AB-pozytywnych vs. ≤29% (ICSI) (Hammadeh i wsp., 1996), y ≥30% DFI vs. >15–<30% lub vs. ≤15% (IVF i ICSI) (Chen i wsp., 2020; Yang i wsp., 2019), y ≥30% SDF vs. <30% (IVF i ICSI) (Borges i wsp., 2019; Sun i wsp., 2018; Sivanarayana i wsp., 2013;Wang i wsp., 2014), y >30% plemników ze denaturowanym DNA vs. >15–30% lub vs. 0–15% (ICSI) (Zini i wsp., 2005), y >35% SDF vs. ≤35% (IVF, ICSI) (Anifandis i wsp., 2015), y >36,5% plemników TUNEL-pozytywnych vs. ≤36,5% (IVF i ICSI) (Henkel i wsp., 2003). Ponadto nie wykazano różnic w odsetku zapłodnionych oocytów (metoda ICSI) w przypadku wykorzystania wyselekcjonowanego nasienia (komora ZyMōt™5) zawierającego średnio 1,2 ±0,4% plemników TUNELpozytywnych oraz wyselekcjonowanego nasienia (wirowania na gradiencie stężeń – DGC, ang. density gradient centrifugation) zawierającego średnio 18,5 ±11,00% plemników TUNEL-pozytywnych (Parrella i wsp., 2019). Nie stwierdzono również istotnych korelacji między odsetkiem zapłodnionych oocytów a wynikami testu: y AB (IVF i ICSI) (Hammadeh i wsp., 1998; Razavi i wsp., 2003; Sadeghi i wsp., 2011), y CMA3 (ICSI) (Sadeghi i wsp., 2011), y SCD (IVF i ICSI) (Antonouli i wsp., 2019; Tandara i wsp., 2014), y SCSA (IVF i ICSI) (Larson-Cook i wsp., 2003), y TB (ICSI) (Sadeghi i wsp., 2011).

Wpływ statusu chromatyny plemników na rozwój zarodków w 2.–3. dobie po zapłodnieniu

W 2.–3. dobie po zapłodnieniu metodą in vitro ocenie podlega blastomerowa budowa zarodka. W 2. dobie między 26 h a 44 h ±1 h po zapłodnieniu powinien nastąpić podział mitotyczny zygoty (ang. first cleavage), w efekcie czego powstaje 2 blastomerowy zarodek. Kolejnej oceny dokonuje się w 44 h ±1 h po zapłodnieniu – prawidłowy zarodek wykazuje 4 blastomerową budowę. Z kolei po 68 h ±1 h prawidłowy embrion ma 8 blastomerową budowę. Poza liczbą blastomerów jednocześnie ocenie podlega ich symetria i jakość cytoplazmy. W efekcie stosuje się 3-znakowy system ewaluacji, gdzie pierwszy symbol – cyfra odpowiada liczbie blastomerów, drugi symbol – litera odpowiada wzajemnej symetryczności blastomerów (A – blastomery symetryczne; B – blastomery nierównych kształtów, C – cytoplazmatyczne defekty blastomerów), trzeci symbol – cyfra odpowiada stopniowi fragmentacji cytoplazmy (1 – brak fragmentacji cytoplazmy; 2 – fragmentacja <30%; 3 – fragmentacja 30–50%; 4 – fragmentacja cytoplazmy >50%) (rycina 3) (Baczkowski i wsp., 2004; ESHRE, 2017; Gill i wsp., 2018; Nasiri i Eftekhari-Yazdi, 2015; Tang i wsp., 2020; Wdowiak i wsp., 2015).

Wraz ze wzrostem odsetka plemników z obniżonym statusem chromatyny rośnie ryzyko nieprawidłowego rozwoju zarodka w 2.–3. dobie po zapłodnieniu

Wyniki badań Velez de la Calle i wsp. (2008) wskazują, że wraz ze wzrostem stopnia uszkodzeń chromatyny plemników maleje odsetek zarodków o prawidłowej budowie blastomerowej. Wykazano, że mężczyźni z par, dla których uzyskano zarodki o optymalnej budowie morfologicznej, w 2. dobie po zapłodnieniu (metody IVF i ICSI) mieli istotnie niższy odsetek SDF (22,32% SDF) niż mężczyźni z par, dla których uzyskano zarodki niższej jakości (22,41% SDF). Inne badania, przeprowadzone przez Simon i wsp. (2010), potwierdzają także wpływ jakości DNA plemników na wczesną embriogenezę w grupach leczonych metodą IVF i ICSI. Autorzy ujawnili większy odsetek zarodków morfologicznie prawidłowych w 3. dobie, u par, w których mężczyźni mieli 0–20% plemników z pofragmentowanym jądrowym DNA (test kometowy) w porównaniu z parami, w których mężczyźni mieli 61–100% lub 41–60% plemników z nieprawidłową integralnością genomu plemników. W kolejnych badaniach ujawniono istotnie mniej zarodków morfologicznie prawidłowych ocenianych w 2. i 3. dobie po zapłodnieniu (metoda IVF i ICSI), gdy wykorzystano nasienie zawierające 71–100% plemników z pofragmentowanym jądrowym DNA (test kometowy) vs. ≤30% plemników z pofragmentowanym jądrowym DNA (Simon strona 13 -------------- zdjecia str14 i wsp., 2014). Podobnie w innych publikacjach autorzy donoszą o uzyskaniu mniejszej liczby zarodków morfologicznie prawidłowych w 3. dobie dla par, w których mężczyźni mieli: y ≥21% SDF vs. 11–20% lub vs. ≤10% (IVF) (Zheng i wsp., 2018), y >30% SDF vs. ≤30% (ICSI) (Borges i wsp., 2019), y ≥30% SDF vs. <30% (ICSI) (Sivanarayana i wsp., 2013). Co więcej, wykazano, że efekt dużego halo6 w teście SCD miał dobrą wartość prognostyczną (AUC = 0,830, przy optymalnej wartości granicznej 28% plemników z dużym halo) dla prawidłowego rozwoju zarodków ocenianych w 3. dobie po zapłodnieniu metodą IVF, podczas gdy pełna ocena fragmentacji DNA plemników w tym teście (patrz przypis 6) miała satysfakcjonującą wartość prognostyczną (AUC = 0,710, przy optymalnej wartości granicznej 26% SDF) (Tandara i wsp., 2014). Uzupełnieniem powyższych danych są wyniki badań, w których stwierdzono istotne ujemne korelacje między prawidłowym rozwojem zarodka w 2. i 3. dobie a fragmentacją jądrowego DNA ocenianą w teście kometowym (odpowiednio, r = −0,486 i r = −0,648; metoda ICSI) (Nasr-Esfahani i wsp., 2005) oraz między prawidłowym rozwojem zarodka ocenianym w 3. dobie a wartością odsetka plemników TUNEL-pozytywnych (r = −0,640, metoda ICSI) (Avendaño i wsp., 2010). Wartość przytoczonych współczynników korelacji nie wskazuje na słabą siłę asocjacji, lecz na umiarkowaną. Nie można pominąć faktu, że związek między statusem chromatyny a rozwojem zarodka może być zależny m.in. nie tylko od liczby plemników z uszkodzoną chromatyną, ale także od doby rozwoju zarodka, zastosowanego testu weryfikującego dojrzałość i integralność chromatyny oraz wykorzystanej metody zapładniania in vitro. Wykazano bowiem istotne różnice w odsetku zarodków morfologicznie prawidłowych w 2. dobie, po zapłodnieniu metodą ICSI, uzyskanych dla par, w których mężczyźni mieli >30% lub >15–30% plemników ze zdenaturowanym DNA vs. 0–15% (test z OA), nie wykazując tych różnic w odsetku zarodków morfologicznie prawidłowych w 3. dobie (Zini i wsp., 2005). Z kolei inne badania przeprowadzone przez Niu i wsp. (2011) na grupie pacjentów leczonych metodą IVF nie ujawniły istotnych różnic w odsetku zarodków morfologicznie 6 Efekt halo w teście SCD tworzony jest przez pętle DNA wyrzucane poza główkę plemnika, jeśli genomowe DNA jest integralne. Efekt ten uznawany jest za duży (duże halo), gdy jego średnica jest ≥ od średnicy główki plemnika, a za średni, gdy średnica jest >⅓ średnicy główki. Natomiast jeśli halo jest ≤⅓ średnicy główki plemnika lub nie występuje mimo wybarwienie główki bądź też stwierdza się tylko częściowo wybarwioną główkę albo niewybarwioną, uznaje się, że genomowe DNA uległo fragmentacji. prawidłowych w 2. dobie w zależności od odsetka plemników z nieprawidłowym statusem chromatyny (>27% DFI vs. ≤27% lub >15% HDS vs. ≤15%). Z drugiej strony autorzy ci ujawnili istotnie wyższy odsetek zarodków morfologicznie prawidłowych w 3. dobie (≤27% DFI vs. >27% DFI). Wyniki te potwierdzają również badania Tang i wsp. (2020), w których stwierdzono istotnie niższy odsetek prawidłowych zarodków w 3. dobie po zapłodnieniu metodą IVF uzyskany dla par, w których mężczyźni mieli astenozoospermię i >31,25% SDF w porównaniu z mężczyznami z astenozoospermią i ≤31,25% SDF, natomiast w badaniach tych nie wykazano różnic, gdy badani mieli normozoospermię i >31,25% SDF w porównaniu z mężczyznami z normozoospermią i ≤31,25% SDF. Z kolei dane uzyskane przez Sadeghi i wsp. (2009) pokazują niebagatelne znaczenie zastosowanego testu weryfikującego status chromatyny plemników w przypadku oceny wpływu jej uszkodzeń na rozwój zarodków. Autorzy wykazali istotnie niższy odsetek prawidłowych zarodków w 3. dobie uzyskanych dla par, w których mężczyźni mieli ≥30% plemników CMA3-pozytywnych vs. <30% (metoda ICSI), jednak nie ujawnili tych różnic, kiedy zastosowano test AB, TB oraz OA. Zgodnie z sugestią Sadeghi i wsp. (2009) można uznać, że w przypadku badanej grupy mężczyzn poziom protaminacji chromatyny plemników (komórki CMA3-pozytywne z deficytem protamin) decydujący o jej upakowaniu mógł mieć istotny wpływ na rozwój zarodka w 3. dobie. Inne badania, które obejmowały porównanie par, w których mężczyźni mieli >30% DFI, >20–≤30% DFI, >10–≤20% DFI lub ≤10% DFI, nie wykazały różnic w odsetku zarodków morfologicznie prawidłowych ocenianych zarówno w 2., jak i 3. dobie, gdy grupa badana nie była wyselekcjonowana w zależności od zastosowanej procedury zapłodnienia (IVF i ICSI). Natomiast gdy wyniki analizowano osobno dla grupy leczonej metodą IVF i grupy leczonej metodą ICSI, ocena statystyczna ujawniła wpływ uszkodzeń DNA plemników na rozwój zarodków: 1) dla wyizolowanej grupy pacjentów leczonych metodą IVF wykazano niższy iloraz szans na uzyskanie zarodków dobrej jakości w 2. dobie, gdy wartość DFI była >30% lub >20–≤30% vs. ≤10%, 2) dla wyizolowanej grupy pacjentów leczonych metodą ICSI stwierdzono istotnie niższy iloraz szans na osiągniecie zarodków o prawidłowej budowie w 2. dobie tylko w przypadku, gdy wartość DFI była >20–≤30% vs. ≤10% (Oleszczuk i wsp., 2016). Uzyskiwane przez badaczy korelacje między stopniem uszkodzenia plemnikowego DNA a rozwojem embrionalnym nie zawsze są oczywiste. Stwierdzono istotne dodatnie korelacje między SDF a czasem osiągnięcia przez zarodek stadium 2 blastomerów (r = 0,650), 3 blastomerów (r = 0,644) oraz 4 blastomerów (r = 0,677) po zapłodnieniu metodą ICSI, nie wykazano jednak tych zależności w przypadku osiągnięcia przez zarodek stadium 5, 6, 7, 8 i 9 blastomerów (Wdowiak i wsp., 2015). W kolejnych badaniach także ujawniono istotne ujemne korelacje (r = −0,242) między SDF a rozwojem zarodka ocenianego w 3. dobie po zapłodnieniu, ale metodą IVF. Nie stwierdzono tych korelacji w przypadku zapłodnienia metodą ICSI (Pregl Breznik i wsp., 2013).

Brak wpływu statusu chromatyny plemników na rozwój zarodka w 2.–3. dobie po zapłodnieniu

Część autorów nie stwierdza statystycznie istotnego wpływu uszkodzeń chromatyny plemników na rozwój zarodków ocenianych w 2. i/lub 3. dobie. W badaniach tych nie wykazuje się różnic w odsetku zarodków morfologicznie prawidłowych, porównując zarodki uzyskane dla par, w których mężczyźni mieli: y >15% HDS vs. 5–15% lub vs. <5% (IVF i ICSI) (Lin i wsp., 2008), y ≥20% SDF vs. <20% (IVF i ICSI) (Sun i wsp., 2018), y >22,30% SDF vs. ≤22,30% (IVF i ICSI) (Xue i wsp., 2016), y >27% DFI vs. 9–27% lub vs. <9% (IVF i ICSI) (Lin i wsp., 2008), y >29% plemników AB-pozytywnych vs. ≤29% (IVF) (Hammadeh i wsp., 1996), y ≥30% DFI vs >15–<30% lub vs. ≤15% (IVF i ICSI) (Yang i wsp., 2019), y ≥30% SDF vs. <30% (IVF i ICSI) (Sun i wsp., 2018), y >30% plemników CMA3-pozytywnych vs. <30% (ICSI) (Nasr-Esfahani i wsp., 2004), y >35% SDF vs. ≤35% (IVF i ICSI) (Anifandis i wsp.,2015). Niektórzy autorzy nie ujawnili również korelacji między parametrami morfokinetycznymi zarodków ocenianych w 2.–3. dobie po zapłodnieniu a wynikami testu AB (metody IVF i ICSI) Hammadeh i wsp., 1998;) (Muriel i wsp., 2006) (Sadeghi i wsp., 2011), SCSA (metody IVF i ICSI) (Larson-Cook i wsp., 2003) (Muriel i wsp., 2006) oraz SCD (metody IVF i ICSI) (Muriel i wsp., 2006) Podobnie w badaniach autorskich (Gill i wsp., 2018) nie stwierdzono różnic w odsetkach plemników AB-, TB- i CMA3-pozytywnych między mężczyznami z par, dla których osiągnięto >50% lub ≤50% zarodków morfologicznie prawidłowych w 3. dobie po zapłodnieniu metodą ICSI. Co więcej, w badaniach tych nie stwierdzono, aby testy te miały wartość predykcyjną dla uzyskania prawidłowych morfologicznie zarodków w 3. dobie po zapłodnieniu.

Wpływ statusu chromatyny plemników na rozwój zarodków w 4.–6. dobie po zapłodnieniu

92 h ±2 h po zapłodnieniu embrion powinien znajdować się w stadium moruli zbudowanej z >10 ściśle przylegających do siebie blastomerów (kompakcja blastomerów) (Kovacic i wsp., 2004) . Następnie w 5. dobie (116 h ±2 h po zapłodnieniu) prawidłowo rozwijający się zarodek osiąga stadium blastuli i tworzy się jej jama (blastocel), która stopniowo zaczyna wypełniać zarodek. Wraz ze wzrostem objętości blastocelu pojawia się polaryzacja komórek, część komórek zgrupowanych na jednym z biegunów zarodka tworzy węzeł zarodkowy (embrioblast, ICM, ang. inner cell mass), natomiast druga pula komórek rozlokowana jest na obwodzie blastocysty i ulega spłaszczeniu, tworząc trofoektodermę (trofoblast, TE, ang. trophoblast). Jednocześnie blastocysta rozpręża się (objętość blastocelu staje się większa niż wczesna blastocysta), a osłona przejrzysta stopniowo staje się coraz cieńsza, co umożliwia wylęganie się zarodka przed jego implantacją do endometrium macicy (rycina 4) (Baczkowski i wsp., 2004;) (ESHRE, 2017;) (Gardner i wsp., 2000;) (Gill i wsp., 2018;) (Kovacic i wsp., 2004;) ( Nasiri i Eftekhari-Yazdi, 2015;) (Tang i wsp., 2020;) (Wdowiak i wsp., 2015) . Wraz ze wzrostem odsetka plemników z obniżonym statusem chromatyny rośnie ryzyko nieprawidłowego rozwoju blastocysty Wpływ jakości ojcowskiego materiału genetycznego na rozwój blastocysty potwierdzają publikacje, w których wykazano istotnie niższy odsetek zarodków osiągających stadium blastocysty dla par, w których mężczyźni mieli ≥10% plemników TUNEL-pozytywnych vs. <10% (metody IVF i ICSI) (Benchaib i wsp., 2003), ≥21% SDF vs. 11–20% lub vs. ≤10% (metoda IVF) (Zheng i wsp., 2018) lub ≥30% SDF vs. <30% (metoda ICSI) (Borges i wsp., 2019; Sivanarayana i wsp., 2013). Uzupełnieniem tych wyników są badania Borges i wsp. (2019), w których wykazano niższy odsetek blastocyst o prawidłowej budowie morfologicznej, gdy mężczyźni mieli ≥30% SDF vs. <30% (metoda ICSI). Stwierdzono także, że dla par, w których mężczyźni mieli 71–100% plemników z uszkodzonym DNA vs. 0–30% (test kometowy), osiągnięto istotnie więcej zarodków morfologicznie nieprawidłowych w 5. dobie po zapłodnieniu metodą IVF (Simon i wsp., 2014).

Nieoczywisty wpływ statusu chromatyny plemników na rozwój blastocysty

Istnieją badania, w których nie wykazano korelacji między SDF a czasem osiągnięcia przez zarodek stadium moruli, natomiast wykazano istotne ujemne korelacje między SDF a czasem osiągnięcia stadium blastocysty (r = 0,537) po zapłodnieniu metodą ICSI (Wdowiak i wsp., 2015). Z kolei w innych badaniach nie wykazano tej korelacji w przypadku ICSI, ale ujawniono ją, kiedy zastosowano metodę IVF (r = −0,310) (Pregl Breznik i wsp., 2013). Interesujące wyniki opublikowali Tang i wsp ZDJECIA str.17 -------WPŁYW STATUSU CHROMATYNY PLEMNIKÓW LUDZKICH NA WYNIKI ROZRODU W WARUNKACH IN VITRO (2020), którzy wykorzystując procedurę IVF, wykazali istotnie niższy odsetek prawidłowych morfologicznie blastocyst uzyskanych dla par, w których mężczyźni mieli astenozoospermię i >31,25% SDF (vs. mężczyźni z astenozoospermią i z ≤31,25% SDF). Natomiast w przypadku par, w których mężczyźni mieli >31,25% SDF vs. ≤31,25% i jednocześnie normozoospermię, tych różnic nie wykazano. Warto podkreślić, że zarówno w przypadku analizy odsetka zarodków morfologicznie prawidłowych ocenianych w 5. dobie po zapłodnieniu dla całej badanej grupy pacjentów (bez uwzględnienia rodzaju procedury zapłodnienia pozaustrojowego), jak i dla wyizolowanych grup leczonych metodą IVF i ICSI nie ujawniono różnic statystycznie istotnych między parami, w których mężczyźni mieli >30% DFI, >20–≤30% DFI lub >10–≤20% DFI (vs. ≤10%) (Oleszczuk i wsp., 2016). Natomiast gdy podjęto próbę oszacowania ilorazu szans na uzyskanie zarodków dobrej jakości w 5. dobie, wyniki analizy statystycznej były różne w zależności od zastosowanej metody zapłodnienia in vitro. Istotnie niższy iloraz szans na uzyskanie zarodków stwierdzono w przypadku par leczonych metodą IVF, w których mężczyźni mieli >30% DFI lub >20–≤30% DFI (vs. ≤10%), z kolei w przypadku par leczonych metodą ICSI wykazano niższy iloraz szans tylko dla par, w których mężczyźni mieli >20–≤30% DFI (vs. ≤10%) . (Oleszczuk i wsp., 2016)

Brak wpływu statusu chromatyny plemników na rozwój blastocysty

Nie zawsze potwierdza się związek między uszkodzeniami chromatyny a rozwojem blastocysty. (Green i wsp.(2020)) nie zaobserwowali różnic w liczbie blastocyst między grupami, w których mężczyźni mieli >15% DFI vs. ≤15% (metoda ICSI). Podobnie w opisanych już badaniach przeprowadzonych przez (Parrella i wsp.(2019)) nie stwierdzono różnic statystycznie istotnych w odsetku zarodków morfologicznie prawidłowych w 5. dobie (metoda ICSI), gdy porównywano pary, dla których po selekcji nasienia (komora ZyMōt) uzyskano średnio 1,20 ±0,40% plemników TUNEL-pozytywnych vs. pary, dla których uzyskano średnio 18,50 ±11,00% plemników TUNEL-pozytywnych (metoda DGC). Co więcej, w innych badaniach nie wykazano istotnych korelacji między rozwojem zarodka w 5. dobie a wynikami testu SCSA (metody IVF i ICSI) (Larson-Cook i wsp., 2003) (Antonouli i wsp., 2019;) (Muriel i wsp., 2006) . Również badania autorskie (Gill i wsp., 2018) nie ujawniły różnic w odsetkach plemników AB-, TBi CMA3-pozytywnych między mężczyznami z par, dla których osiągnięto >50% lub ≤50% zarodków morfologicznie prawidłowych w 5. dobie po zapłodnieniu metodą ICSI, jak również nie wykazały, aby testy te miały wartość predykcyjną dla uzyskania >50% morfologicznie prawidłowych blastocyst po procedurze ICSI.str.19